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ライフサイエンス研究分野全体への広がり

顕微鏡は詳細な細胞画像や形態情報を得ることができ、細胞機能の研究に有用な科学的ツールです。しかし、顕微鏡画像の解釈は主観的で定性的であり、手間がかかる場合があります。

フローサイトメトリーは定量的な表現型解析に優れており、大量の細胞を迅速に調べることで統計的に堅牢な結果を得ることができます。しかし、フローサイトメトリーはイメ－ジング能力を欠いているため、細胞内局在や機能的な研究は、理想的な条件下でさえ困難です。

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターは、フローサイトメトリーのスピード、感度、表現型解析能力と顕微鏡の詳細な画像および機能的洞察を組み合わせることで、両技術の限界を克服し、新たなアプリケーションへの幅広い扉を切り開きます。

高機能フローサイトメトリー

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターは、フロー中のすべての細胞について、明視野、暗視野(SSC)、および最大10種の蛍光マーカーを含む複数の画像を高速で取得します。Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターのカメラは、ピクセルサイズが0.1µm²(倍率60倍)、0.25µm²(倍率40倍)、1µm²(倍率20倍)で動作し、細胞膜、細胞質、細胞内小器官、核からの蛍光の位置を高解像度で視覚化します。

Cytek Amnis™イメージングフローサイトメーターの革新的な設計はシグナルを増加させ、ノイズを最小化し、卓越した光感度をもたらします。専用の側方散乱レーザー、調節可能なレーザー強度、細胞サイズを直接測定するための明視野画像などの細部にわたる設計により、高額なフローサイトメーターシステムよりも効果的に細胞集団を分離できます。使いやすさ、卓越した性能、そして各細胞の画像化は、フローサイトメトリーの初心者から専門家までのニーズに対応します。

感度が高く柔軟性があり、さまざまな研究ニーズに対応

卓越した蛍光感度
Cytek Amnis™イメージングフローサイトメーターの特許取得済みアーキテクチャは、可視スペクトル全域にわたって、かつてない蛍光感度を提供し、他のイメージングデバイスを凌駕します。以下の4つのプロットは、Cytek Amnis™イメージングフローサイトメーターがFITCからPE-Cy7のスペクトル全体にわたり、8-ピークキャリブレーションビーズセット(Spherotech社)のすべての強度を識別できることを示しています。FITCからPE-Cy7チャネルにかけての明確なピークの分離、低い変動計数(CV)、高い感度にご注目ください。

Cytek Amnis™イメージングフローサイトメーターによる直径3ミクロンの8-ピークレインボービーズの12チャネル画像

画像情報に基づく確かなゲーティング

データ取得ソフトウェア

迅速かつ簡単

Cytek INSPIRE™ソフトウェアは、強力な画像ベースのゲーティングとリアルタイムの蛍光補正を可能にします。

1. インスタントポピュレーションビューア：
   ゲートを描画するとすぐにそのゲート内の細胞集団がプルダウンリストに自動的に追加されます。データ取得中に、そのリストから興味のある細胞集団を選択するだけで、対応する細胞を視覚的に確認できます。
2. イメージギャラリー：
   興味のある細胞の画像が取得されるとすぐにイメージギャラリーに表示されます。これにより、細胞形態の確認、染色パターン評価、レーザー出力の設定を最適化できます。
3. 一目でわかる機器ステータス：
   便利なゲージ、インジケーター、およびテキストアラートにより、機器の動作ステータスが継続的に更新されます。
4. リアルタイム蛍光補正：
   ユーザーフレンドリーな自動補正ウィザードが、マルチカラーの蛍光補正マトリクスの設定手順を素早くガイドします。
5. 確実なゲーティング：
   グラフィックツールを使用して簡単にゲートを設定し、ゲーティングされた細胞の視覚的検証により精度を確認できます。
6. 無駄なくサンプルをロード：
   サンプル容量の最大95％が利用できるため、希少細胞の分析や未使用サンプルの回収も可能です。
7. 直観的なサンプル取得：
   シンプルで直観的なインターフェースにより、サンプル取得設定とデータ保存基準を制御できます。
8. 汎用的なドットプロットとヒストグラム：
   データプロットは従来のフローサイトメーターと同様にリアルタイムで更新されますが、Cytek Amnis™イメージングフローサイトメーターは、面積、細胞の幅、細胞の高さ、アスペクト比などの形態学的パラメータもプロットすることが可能です。

Cytek INSPIRE™ソフトウェア

データ解析ソフトウェア

Cytek IDEAS™ソフトウェアは、Machine LearningおよびAmnis™ AIソフトウェアを搭載することができ、画像解析、統計的な厳密性、そして視覚的確認を統合した使いやすいソフトウェアスイートです。このソフトウェアは、Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターのデータセットとシームレスに連携します。

1. ポピュレーションの検証：
   イメージギャラリーを使って各細胞の画像を見ることができます。また「バーチャルセルソーティング」を行い、特定の集団内の細胞を検証し確認することも可能です。
2. 各ドットに対応する画像：
   すべてのスキャッタープロット中の各ドットは対応する細胞画像にリンクされています。ドットをクリックするだけで関連する細胞画像を見ることができ、その逆も可能です。
3. 視覚的にポピュレーションを定義：
   親しみやすいグラフィックツールを用いてポピュレーションを定義し、それらを組み合わせるための操作を行います。
4. 包括的なポピュレーションの統計：
   細胞の形態、表現型、機能の違いを明らかにするための幅広い統計指標を用いて、細胞集団を詳細に特性づけます。
5. 柔軟な画面表示ツール：
   レポート作成やパブリケーション向けに、合成画像、疑似色表現、その他の様々な画像変換を作成することができます。
6. 画像情報のグラフ化：
   画像で確認できるほぼ全ての内容をヒストグラムやドットプロットとして表示することが可能です。蛍光強度、蛍光局在、細胞形態、細胞のテクスチャ、その多数の形態学的特長や光学的特長など、数百ものパラメータがすべての細胞について計算されます。
7. 機械学習モジュール：
   Cytek IDEAS™ソフトウェアの分析に含まれる何千ものフィーチャーを用いて、重要なポピュレーションの分離を最大化するように設計されたコンピューターラーニングの機能と、実験固有の最適なスーパーフィーチャーを創出する能力を追加します。

Cytek Amnis™ AI解析ソフトウェア：
スタンドアローンの本ソフトウェアは、畳み込みニューラルネットワークを使用したディープラーニングを活用することで解析を大幅に簡素化し、微細な細胞の違いも正確に識別します。さらに、コンピューターを使用したタグ付け、ユニークな細胞タイプの識別用のオブジェクトマップロット、そして高精度の解析機能の搭載により、Cytek Amnis™Image StreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターのデータでのAIの利用がこれまで以上に簡単になりました。

Machine Learningソフトウェアの搭載が可能なCytek IDEAS™ソフトウェア

豊富なアプリケーション

アプリケーションの可能性は無限

代表的なアプリケーション
次で紹介するアプリケーションは、Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターと、Machine Learningソフトウェアを搭載した画像解析ソフトウェアCytek IDEAS™を用いて実現可能な研究の一例を示しています。

思い描くアプリケーションに適応

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターは、細胞研究のための汎用プラットフォームとして設計されており、本WEBページに記載されているアプリケーションに限定されるものではありません。

蛍光画像のSimilarity解析による核移行の定量化

60倍の倍率によるNF-κBシグナル伝達の詳細解析
細胞質から細胞核へのNF-κBの移行は、の以降は、細胞ストレス因子の存在に対する応答において重要なイベントです。イメージングフローサイトメーターは、数千もの細胞における局在変化を定量的に分析する上で優れています。ここでは、未刺激またはLPSで刺激したTHP-1細胞をAnti-NF-κB抗体および核を蛍光染色する7-AADで染色し、60倍の対物レンズを用いたCytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターを使用して細胞を取得しました。Cytek IDEAS™ソフトウェアのSimilarityフィーチャーは、NF-κBが細胞質内に存在する細胞(黄色のヒストグラム)と核移行している細胞(青色のヒストグラム)を明確に分離することが出来ます。

定量的なイメージングと堅牢な集団統計

定量的なイメージングとは、Cytel Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターが強力で直感的な画像処理パッケージを備えていることを意味します。数千の解析パラメータと最適化された解析ウィザードがあり、核移行、形態変化、内在化、アポトーシスなどの一般的な画像ベースのアプリケーションに使用できます。

大量の細胞に対する客観的で定量的な画像解析は、データ報告のための膨大な統計パラメータによって裏付けされています。

共局在とトラフィッキング

Cytel Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターは、多数の細胞画像を迅速に取得し、細部にわたるSimilarityを客観的に評価することで、共局在化研究に大幅に向上させます。

例：初代形質細胞様樹状細胞(pDC)におけるCpGBの内在化とトラフィッキング

図A：pDC内のCpGBのリソソームへの輸送を、Internalization(Y軸)とBright Detail Similarity(X軸)のスコアを用いてプロットしました。

図B：40倍の対物レンズを用いて取得されたpDC(橙)、CpGB(赤)、リソソーム(緑)の局在像を重ね合わせた画像です。上段から、細胞表面にCpGBが結合しているもの(図A 左下領域)、CpGB分子がpDC細胞に内在化してInternalizationスコアが増大したもの(図A 左上領域)、CpGBがリソソームに輸送され、CpGBとリソソームの画像ペアのSimilarityスコアが増大したもの(図Ａ 右上領域)

データは、ニュージャージー医科歯科大学のPatricia Fitzgerald-Bocarsly博士よりご提供いただきました。

アポトーシスとネクローシス

画像解析によるアポトーシスとネクローシスの検出

アポトーシスウィザードは、核染色を含むあらゆるサンプルのアポトーシスを検出するために、各細胞の核形態と明視野画像のコントラストを分析します。

ネクローシスとアポトーシス

従来のフローサイトメーターは、膜不透過性の染色試薬を使用して、膜の完全性を失った死細胞や細胞死に至る細胞を識別できます。しかし、細胞死がアポトーシスによるものなのか、ネクローシスによるものなのかを判断することは困難です。Cytel Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターは、各細胞の核形態を明らかにすることで、この判別を容易にします。ヨウ化プロピジウム(PI)で標識したTHP-1細胞のサンプルで示されるように、ネクローシス細胞の核は正常な核形態をしていますが、アポトーシス細胞の核は収縮し、断片化しています。

オートファジー

オートファジーが誘導されると細胞質内のLC3はプロセシングされ、オートファゴソームの外膜に集積します。オートファジーを起こしている細胞は、Cytek IDEAS™ソフトウェアパッケージのSpot Count機能を使用してLC3の斑点を可視化し、各細胞内のスポットを数値化することで判定することができます。

例：ヒト骨肉腫細胞株U2OS細胞におけるオートファジー

血清飢餓はU2OS細胞におけるオートファジーを誘導します。このデータ、Cytek IDEAS™ソフトウェアのSpot Count機能を使用して、正常な細胞とオートファジーを起こしている細胞とのテクスチャの違いを定量化した例を示しています。

U2OS RFP-LC3ヒト骨肉腫レポーター細胞株を37℃で4時間飢餓状態にし、その後コントロールと飢餓状態のサンプルの両方に分解阻害剤を添加しました。FlowCellect™ RFP-LC3 Reporter Autophagy Kit(カタログ番号FCCH100183)を使用。

細胞形態

例：初代単球における形態変化

化学誘引物質のMCP-1は、単球の形態変化と炎症部位への遊走を誘導します。このことはMCP-1を投与したサンプルのCircularityスコアが、未投与のコントロールに比べて有意に低下していることからも明らかです。一方、自己免疾患の治療薬など、炎症反応を抑制する治療では、Circularityスコアが増加します。

微細藻類

微細藻類の混合培養

以下の画像は、40倍の倍率でCytek Amnis™ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターを使用し、形態学的パラメーターと画像解析を用いて混合培養中の微細藻類の識別を行ったものです。

微細藻類の品質管理

以下の画像は、微細藻類の混合培養中の細菌の混入、細胞の残骸、および集団の検出を示しています。細菌が混入したT.pseudonanaとC.crypticaの混合培養を60倍の倍率でCytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターで分析しています。

免疫シナプスにおける細胞間相互作用の重要性

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーター60倍画像

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターのモジュラーオプション

進化するエンジニアリングによるパフォーマンスの向上

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターの仕様

科学的洞察への道…

Cytek Amnis™のマルチスペクトル分解素子を通過することにより、細胞ごとに明視野、レーザー散乱、および複数の蛍光画像を同時に取得することができます。

Cytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターの光学レイアウト

Amnis™スペクトラルイメージングチャネルに対応する蛍光色素

上表は利用可能な蛍光色素の一部であり、ここに列挙されている蛍光色素は同等の励起・蛍光スペクトルを持つ蛍光色素で置き換えることができます。
また、上表12チャネルシステムのCytek Amnis™ ImageStreamTMXMk II イメージングフローサイトメーターで使用可能な蛍光色素を示しています。6チャネルシステムの場合Channel1から6に示される蛍光色素を用いることができます。

*蛍光色素によっては複数のレーザーで励起されます。
+375nmレーザーは405nmレーザーの搭載システムではCh1に配置され、405nmレーザーの非搭載システムではCh7に配置されます。
明視野像は使用する蛍光チャネルに応じて任意のチャネルで取得できます。

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