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アプリケーションノート
Application Note：骨髄由来間葉系間質細胞の大量凍結保存の実践
骨髄由来間葉系間質細胞の大量凍結保存の実践
藤田医科大学東京 ミルテニーバイオテク株式会社 ワケンビーテック株式会社
間葉系間質細胞(Mesenchymal Stem Cell:MSC)は、再生医療業界で、自家細胞での大量培養および凍結保存の需要が高まっています。この度、我々は、凍結保存溶液として、医薬品製造に利用されているCryoStor CS10および医療機器であるクライオマックス凍結バッグを利用して、従来からのバイアルによる細胞凍結保存、および凍結保存前と凍結保存後の細胞の比較を行いました。
本実験データは、藤田医科大学東京 先端医療研究センター 遠山研究室のご協力により、取得致しました。
細胞凍結工程
CryoStor CS10 製造用細胞凍結溶液
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DMSOを用いて製剤化されたCryoStorは、凍結、貯蔵および解凍プロセス中に細胞や組織に安全な保護環境を提供し、血清、蛋白質を使用せず、凍結保存プロセスに対する分子生物学的反応を調節することにより、細胞の生存率と機能性を維持します。
特長
- 無血清・無蛋白
- USP/最高品質成分使用
- cGMP環境下製造
- FDAマスターファイル登録済
- USP<71>、USP<85>試験済
造血細胞凍結保存用バッグ クライオマックス凍結バッグ
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クライオマックス凍結バッグは、ミルテニーバイオテク社が製造販売する造血細胞凍結保存用バッグです。本製品は医療機器(製造販売業者：ミルテニーバイオテク株式会社、医療機器認証番号：223ACBZX00071000、管理医療機器)であり、血液成分を凍結、保存、解凍するために使用します。
特長
- オーバーラップバッグを使用した二重バッグシステム
- 様々なバッグサイズ(50mL、250mL、500mL、750mL、1000mL) 世界中で入手可能
作業時間
本数の多いバイアルよりもバッグの方が圧倒的に時間短縮可能
| 50mL クライオマックス 細胞凍結バッグ |
2mL凍結バイアル | 対照凍結バイアル | |
 |
 ×13本 |
×2本 |
|
| 液量 | 20mL | 1.5mL×13本 | 1.5mL×2本 |
| 凍結緩慢法 | プログラムフリーザー | BICELL | BICELL |
| 解凍法 | ThawSTAR CB細胞融解ステーション | 37℃ウォーターバス | 37℃ウォーターバス |
解凍後の細胞の評価
バッグ使用による細胞ロスの軽減と品質の維持を実現
①大容量バッグで凍結解凍することで細胞ロスが軽減し対照凍結バイアルと同等の回収率、生存率を示した
| 50mL クライオマックス 細胞凍結バッグ |
2mL凍結バイアル | 対照凍結バイアル | |
| 細胞回収率 | 1.05 | 0.69 | バイアルを1.0とした時 |
| 解凍後の生存率 | 95.50％ | 93.00％ | 95.00％ |
②回収された細胞は未凍結細胞とほぼ同じ増殖能、品質を確認した
5日間培養後増殖率
未凍結細胞：4.6倍 凍結解凍細胞(Bag)：4.7倍
未凍結細胞
バッグ凍結細胞
FCMによるMSCマーカー発現確認
- 陽性マーカー：CD73、CD90
- 陰性マーカー：CD34、CD45
凍結バッグの処理に最適な機器のご紹介
細胞導入ラインの切断にチューブシーラーをご利用ください。
Tube Sealer I (カタログ番号：TS01)
| サイズ(mm) | 165(W)×210(D)×135(H) |
| 重量 | 3kg |
| 電源 | AC 100-240V 50/60Hz 75W |
| 作業時間 | 1.5-4分 |
Tube Sealer(TS01)の利点
⦿シールモードは、Red、Green、Blueの三段階のモードから選択
⦿それぞれのモードの機能は、下記です。
| モード | 余熱温度 | 余熱時間 | シール温度 | シール時間 | 空冷 | 終了温度 |
| Red | 100℃ | 15秒 | 140℃ | 5秒 | 〇 | 65℃ |
| Green | 140℃ | 30秒 | 165℃ | 15秒 | 〇 | 65℃ |
| Blue | 140℃ | 40秒 | 175℃ | 20秒 | 〇 | 65℃ |
⦿様々なバッグサイズでシール可能
50mLバッグ
250mLバッグ
500mLバッグ
通常、市販の凍結バッグでは、PVCやEVAチューブが採用されています。特注で、他の素材、特にC-Flex®やPhaMed®BPT、AdvanteFlex®Cなどを使用されていても問題無くシールすることが可能です。
⦿幅広いシールエリアは、シールの確実性と切断時のミスを防ぎます。
細胞凍結バッグでは、チューブラインをスパイクポートの先端未満の長さにすることが重要です。
(凍結後に残ったチューブラインの破損を防ぎます。)
便利な製品紹介
CryoStor 製造用細胞凍結溶液
細胞および組織のために最適化された保存溶液
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⦿CryoStor CS10 Freeze Media (DMSO 10%)
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 210210 | CryoStor CS10 Bag | 1000mL |
| 210202 | CryoStor CS10 Bag | 100mL |
| 210102 | CryoStor CS10 Bottle | 100mL |
| 210374 | CryoStor CS10 Vial | 16mL |
| 210373 | CryoStor CS10 Vial | 10mL |
⦿CryoStor CS5 Freeze Media (DMSO 5%)
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 205202 | CryoStor CS5 Bag | 100mL |
| 205102 | CryoStor CS5 Bottle | 100mL |
| 205373 | CryoStor CS5 Vial | 10mL |
⦿CryoStor CS2 Freeze Media (DMSO 2%)
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 202102 | CryoStor CS2 Bottle | 100mL |
⦿CryoStor CSB Freeze Media (DMSO 0%)
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 200210 | CryoStor CSB Bag | 1000mL |
| 200102 | CryoStor CSB Bottle | 100mL |
| 200104 | CryoStor CSB Bottle | 500mL |
クライオマックス凍結バッグ、
キャニスター クライオマックス凍結バッグ用
耐衝撃性に優れ、汚染リスクを低減する造血細胞凍結保存用バッグ
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 200-074-400 | クライオマックス凍結バッグ 50 (10-20mL) | 24セット入 |
| 200-074-401 | クライオマックス凍結バッグ 250 (30-70mL) | 24セット入 |
| 200-074-402 | クライオマックス凍結バッグ 500 (55-100mL) | 24セット入 |
| 200-074-403 | クライオマックス凍結バッグ 750 (80-190mL) | 24セット入 |
| 200-074-404 | クライオマックス凍結バッグ 1000 (125-270mL) | 24セット入 |
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| CMBC-50 | キャニスター クライオマックス凍結バッグ 50用 (188×104×12.5mm) 穴付き | 24枚入 |
| CMBC-250 | キャニスター クライオマックス凍結バッグ 250用 (231×152×12.5mm) 穴付き | 24枚入 |
| CMBC-500 | キャニスター クライオマックス凍結バッグ 500用 (267×152×12.5mm) 穴付き | 24枚入 |
| FCMBC-750 | キャニスター クライオマックス凍結バッグ 750用 (305×145×12mm) 穴付き | 24枚入 |
| FCMBC-1000 | キャニスター クライオマックス凍結バッグ 1000用 (380×145×12mm) 穴付き | 24枚入 |
Fisherbrand™ ディスポ滅菌シリンジ
細胞保存溶液の充填、回収に利用できます。
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 14-955-560 | Luer Lock 0.1-1mL | 100本入 |
| 14-955-561 | Luer Lock 3mL | 100本入 |
| 14-955-562 | Luer Lock 5mL | 100本入 |
| 14-955-563 | Luer Lock 10mL | 100本入 |
| 14-955-564 | Luer Lock 20mL | 100本入 |
| 14-955-565 | Luer Lock 60mL | 100本入 |
| 14-955-566 | Luer Slip 0.1-1mL | 100本入 |
| 14-955-567 | Luer Slip 3mL | 100本入 |
| 14-955-568 | Luer Slip 5mL | 100本入 |
| 14-955-569 | Luer Slip 10mL | 100本入 |
| 14-955-570 | Luer Slip 20mL | 100本入 |
| 14-955-571 | Luer Slip 60mL | 100本入 |
Spike Adaptor スパイクアダプター
細胞保存溶液の回収時のスパイクポートを外し、アダプターを利用してシリンジで回収します。
こちらの製品の詳細はお問合せページからご連絡ください。
| カタログ番号 | 品名 | 容量・単位 |
| 220-001-897 | Luer/Spike Interconnector | 5 pieces |
| 220-001-899 | Transfer Set Coupler/Coupler | 5 pieces |