Cytek Aurora CS セルソーターの特長

2022.08.30

製品紹介培養関連

Cytek Aurora CSは、Cytek Auroraシステムのユニークで革新的なテクノロジーの組み合わせにより実現した優れたソーターです。このテクノロジーにより、高性能かつ柔軟性のある細胞分取能力を有しています。
最大5レーザー、3つの散乱光の検出チャネル、64の蛍光検出チャネルを兼ね備えることにより、Aurora CSは、Cytek Auroraが持つパラダイムシフトテクノロジーを最大限に活かし、高機能のソーターに期待する細胞分取能力を提供することを目的に設計されています。
AuroraアナライザーのようにAurora CSもフルスペクトラムプロファイリング(FSP™)テクノロジーによる利点を提供します。光学設計およびアンミキングアルゴリズムにより、アプリケーション毎にシステムの再構成を行うことなく、数多くの新しい蛍光色素の組み合わせを利用できるという、一層の柔軟性を研究者は手にすることができます。最新の光学システムと電子ノイズの低減化によって、高い分解能、高い処理能力と高い感度を実現しています。

これらの結果により、アッセイの複雑さに関わらず、高い自家蛍光を持つ細胞や低発現の重要なバイオマーカーなど、最も解析が困難と思われる細胞集団を解析し、下流の実験検討に使用するための生細胞の単離を可能とする、シングルセルレベルでの高い解像度を発揮するシステムとなっています。
Auroraによって最適化されたアッセイは、Aurora CSでソーティングにも利用することが可能です。この新しい世界を体感してください。

ソーターとしてAurora CSは様々な生物学的条件やソーティング条件を致すために求められる柔軟性を提供しています。最大6種類のソーティング、目的に応じたノズルの選択、ソートモード、ドロップディレイの自動最適化やソートストリームのモニタリングにより、Aurora CSは小さな細胞から大きな細胞まで様々な実験のニーズを満たすために求められる柔軟性を提供します。
SpectroFlo®CSソフトウェアはAurora CSを稼働させるために使用します。ユーザーインターフェース(UI)はカスタマイズ可能な機能を併せ持つ、直感的なワークフローとなっています。
Aurora CSにより、研究はさらに前進し、より深い洞察が得られ、新たな発見の機会が加速します。
多くの細胞が見えることで、多くの細胞が分取可能となります。

INDEX

Aurora CSはCytekの画期的なテクノロジーにより作られています
製品の特長
6ウェイソーティングの検証
回収した細胞をファンクショナルアッセイにて確認
スペクトルの重なりが大きい色素の組合せにおける解像度
スペクトラムプロファイリング(FSP™)テクノロジーによる優れた光学パフォーマンス
SpectroFlo® CSソフトウェアによる解析ワークフロー
SpectroFlo® CSソフトウェアによるソートコントロール

Aurora CSはCytekの画期的なテクノロジーにより作られています

細胞単位の解析を高精度で行います

Aurora CSは最大で67の検出チャンネル(64の蛍光検出チャンネル、FSC、ブルーSSC、バイオレットSSC)を搭載可能です。
また、以下の性能を含む革新的なテクノロジーによって、より強力な高性能ソーターとなっています。

Cytek社独自のCoarse Wavelength Division Multiplexing(CWDM)-高感度半導体検出器アレーによって、365-829nmのレンジにおいて色素が発する蛍光スペクトルの効率的な検出を可能にします
検出帯を多く持つエレクトロニクス設計で、最大67チャンネルまでスケールアップ可能です
バイオレットSSC、レーザービームの高さ方向の狭小化、Cytek社独自のフラットトップレーザーといった3つの設計により卓越した微小粒子の検出能力を実現しました
エアロゾル対策としてHEPAフィルターシステムを搭載
プレートソーティングは電磁的にコントロールされ、また装置表面の清掃は容易に行えます

Cytek® Aurora CSが選ばれる理由は？

利用できるカラー数が非常に多い
近接している蛍光スペクトルを持った蛍光色素を含む40カラーパネルでの実験で実証済みです
卓越した感度と解像度
最新の光学設計と電子ノイズの低減によりこれまでにない感度を実現しました
自家蛍光の除去機能により高い自家蛍光を発するサンプルの解像度を向上させました
柔軟性がもたらす新たな便利さ
蛍光色素に変更するときに光学フィルターを変更する必要はありません
レーザーにより励起される全ての市販の蛍光色素を使用できます
サンプル吸入時には5mLと15mLチューブ、サンプル回収時には96wellプレートや1.5mLと5mLチューブというように様々な種類の容器をサンプルの吸入と回収に使うことができます
流れるような切れ目のないソーティング
ドロップディレイ、ソートモニタリング、クロッグの検出はすべて自動で行われることで信頼に足るソーティング結果が得られます
すべてのソートで使われた設計を包括的なソートレポートとして自動で記録します
Cytek Auroraシステムまたは従来型フローサイトメーターからの移行が容易です

製品の特長

Cytek® Aurora CSはソート設定からサンプルの回収まで、一連の流れを完遂するソーティング性能とアプリケーションに柔軟に対応するように設計されています。ここに挙げているのはいくつかの例にすぎません。より多くの特長をご体験いただくためにデモ機をご用意しています。デモをご要望の場合は以下のリンクボタンからお問い合わせください。

サンプルインプットの柔軟性と制御

Cytek® Aurora CSサンプルローディングチャンバーでは5mLまたは15mLのポリスチレンまたはポリプロピレンチューブが使用できます。SpectroFlo® CSソフトウェアのユーザーインターフェースでは以下のオプションが使用可能です。

チャンバーのライトを点灯し、チューブに残ったサンプルの残量を確認できます
サンプルチューブを撹拌するスピードは3種類から選べます
サンプル吸入・回収の際冷却するのか温めるのか、チャンバー内の温度を設定できます
ソーティング終了後、可能な限り多くの細胞を回収するために、サンプルラインに残ったサンプルをサンプルチューブに流し戻します

ノズル設定の多様性

最良のソーティング結果を得るための最適なノズルの直径は対象とする粒子のサイズと壊れやすさに依存します。70、100μmからノズルサイズを選択しデフォルトの設定を行うか、設定をカスタマイズし、SpectroFlo CSソフトウェアに保存することで以降の測定で同じ設定条件を利用することも可能です。

設定済みのソートモードとカスタマイズ

Cytekの設定済みのソートモードを選択するか、カスタマイズしたソートモードを作成することにより、各ユーザーのソートアプリケーションのニーズを満たすことができます。

Purity
他の細胞集団とのコンタミネーションが無きに等しい状態で、関心のある細胞集団を単離することが可能です。
Single Cell
96wellプレートの各ウェルに細胞を単離することが可能です。

Enrich
ソーティングの純度を下げることでターゲットとする細胞集団を多く取得することを優先します。
Mixed
PurityモードとEnrichモードを組み合わせることができます。

Multiway
4ウェイまたは6ウェイのソーティングを対象とし、効果的な偏向電圧により液滴を制御します。
Custom
アプリケーションにふさわしいソーティング設定を行うことが可能です。

プレートソーティング

SpectroFlor® CSソフトウェアにて各ウェルに対するソート設定を行い、プレートホルダーにプレートを搭載し、そのホルダーを液滴回収ユニットに設置することによって96wellプレートでのソーティングを実行できます。

ハイスループットモードを使用してプレートソーティングを実行する場合、2分以内に一つの細胞を96の各ウェルにソートすることが可能です。インデックスソーティングを使用することにより、ソフトウェアにて分析したプロットがどのウェルに存在するのか追跡し、データをオーバーレイで表示することができます。加えて、それぞれの実験のソート設定と結果に対する包括的な記録が記載された詳細なソートレポートを利用できます。

マルチウェイソーティング

大量のソーティング結果を得るための最適なノズルの直径は対象とする粒子のサイズと壊れやすさに依存します。70、100μmからノズルサイズを選択しデフォルトの設定を行うか、設定をカスタマイズし、SpectroFlo CSソフトウェアに保存することで以降の測定で同じ設定条件を利用することも可能です。

バイオセーフティコントロール

第一のエアロゾル対策としては装置の中に設置された交換可能なHEPAフィルターがあります。SpectroFlor® CSソフトウェアによって設定されたタイマーがフィルターの交換時期をお知らせします。

加えてオプションの対策として設置面積が小さなバイオセーフティクラス2タイプのA
A2キャビネットを使用する方法があります。キャビネット内は左側に本装置を収納しつつ、右側にはアンプルチューブラックやその他の実験室で使用する小さな器具類を置くスペースを確保しています。

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6ウェイソーティングの検証

Cytek® Aurora CSはフルスペクトラムプロファイリング(FSP™)テクノロジーと高精度なソーティング機能を兼ね備えることで細胞試験をより深いところまで掘り下げることができます。Aurora CSの能力を示すため、先進的なエレクトロニクス設計により可能となった28カラーヒト希少Ｔ細胞とＮＫ細胞のイムノフェノタイピングパネルをCytek® Auroraから移行させてAurora CSにて検証します。以下で示されているT細胞とNK細胞における6種類の希少な細胞集団を100μmのノズルを使用してソーティングし、純度を評価しました。

設定済みのソートモードとカスタマイズ

UV	Violet	Blue	Yellow-Green	Red
BUV395 CD45RA	BV421 CCR7	FITC CD57	cFluor YG584 CD4	APC CCR4
LIVE/DEAD Blue	BV480 CD62L	Spark Blue 550 CD14	PE/Dazzle 594 CD337	Sprk NIR 685 CD56
BUV563 CCR5	BV510 CD3	PerCP CD45	PE-Cy5 CD95	APC-R700 CD127
BUV615 CD314	BV650 CD28	PerCP-eFluor 710 TCRγδ	PE-Alexa Fluor 700 CD25	APC-H7 CD27
BUV661 CD39	BV750 CXCR5		PE-Cy7 TIGIT	APC/Fire 810 CD38
BUV737 CD161	BV785 PD-1		PE/Fire 810 HLA-DR
BUV805 CD8

ゲーティング階層により希少な細胞集団をソーティング

ソートされた6種類の細胞集団のソートゲートは、上記のソート戦略図においてオレンジ色で示されています。回収された細胞集団はサンプル中の全細胞に対して0.09から0.40%しか存在していません。それぞれのソートゲートがゲーティング階層のどの階層にあたるかについては、各プロットの右上に緑の四角で表示してあり、その階層は13階層にまで達しています。

ソーティングの純度の確認

以下のプロットにて6種類の回収された細胞集団それぞれの純度を示しています

CD8+ TEMRA TIGIT- CD57+
Purity: 99.5%

CD8+ TEMRA TIGIT+ CD57+
Purity: 99.5%

CD4+ EM TIGIT- CCR4+
Purity: 99.2%

CD4+ TIGIT+ CCR5+
Purity: 99.0%

Tregs CD62L+ CCR4+
Purity: 99.4%

NK TIGIT+ CD38+
Purity: 99.2%

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回収した細胞をファンクショナルアッセイにて確認

下流の研究検討のために細胞をソーティングするときには、回収した細胞が生存し機能を保持していることが重要です。
Cytek® Aurora CSにてこの性能を示すためにヒトPBMCを用意し、以下のゲーティング戦略に基づき、70μmのノズルを用いてCD4+エフェクターメモリー、CD8+エフェクターメモリー、TCRγδT細胞、NK細胞の4種類のソートを行いました。ソートゲートはオレンジ色で示されています。

ソーティングが完了した後、細胞をインキュベーターにて2時間保存し、BFA、monensin、CD107aの存在下でPMAとlonomycineによって刺激を加え、8種類の異なる細胞マーカーにて染色しました。結果は下で示されている一定の観察下での高次元の解析図に示されています。この解析図はSpectroFlo CSソフトウェアを用いて次のページに示されているOMIQと2次元プロットによって生成されたものです。

ソーティング後に細胞を刺激した結果をクラスター化したFlowSOMのUMAPプロット

それぞれの細胞集団からソーティングされた各々の生細胞は、次元削減とクラスターの可視化のためにFlowSOMとUMAPを使うことによってクラスター化されました。上記のスキャタープロットは5つの主なクラスターが識別されていることを示しています。活性化マーカーの発現は色続きのスキャタープロットにて示されています。識別された2つのTCRγδクラスターはIFN-γ、TNF-α、CD107aとgranzyme Bの生成に関する活性化のパターンが明確に反対であることを示しています。

PMAおよびIonomycinによる刺激後、ソーティングされた細胞の機能性評価を表す2次元プロット

CD4+Effecter Memory Cells

CD8+Effecter Memory Cells

TCRγδ T Cells

NK Cells

ソーティングされていない細胞と4つのソーティングされたそれぞれの細胞集団をBFA、monensinとCD107aの存在下でPMAおよびionomycinによって刺激しました。刺激を与えた後、細胞を8種類の異なる細胞内マーカーによって染色しました。細胞はCytek Auroraシステムによって得たもので、結果はSpectroFlo CSの2次元プロットを用いて表示し、CD107aが発現した細胞とサイトカインの生成パターンを可視化しています。ソーティングされていない細胞とされている細胞集団のそれぞれの細胞数は本実験の性質上、異なります。

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スペクトルの重なりが大きい色素の組合せにおける解像度

従来型のフローサイトメトリーでは一部の色素の組合せを検出することはそれらの色素のスペクトルの重なりが大きいためにとても挑戦的なものとなります(Figure1,4)。Cytek® Aurora CSはフルスペクトラムプロファイリング(FSP™)テクノロジーを用いてこれらの検出に対応し、全レーザーの結果を通してスペクトラルシグネチャの違いを検出し、細胞集団が共発現している場合(Figure2,3,5,6)においてもこれらの組み合わせを明確に切り分けることに成功しています。

例1：APCとAlexa Fluor 647

Figure1:従来のスペクトラムビューアーによるスペクトルはAPCとAlexa Fluor 647のスペクトルの重なりが大きいことを示しています。

Figure2:4レーザーのAuroraシステムのスペクトラムプロットはAPCとAlexa Fluor 647のシグネチャが明確に異なることを示しています。

Figure3:健常者の全血を4レーザーAuroraシステムにより染色、溶解、洗浄、分析しました。Alexa Fluor 647で染色したCD56とAPCで染色したCD8が共発現しているNK細胞とNK T細胞の細胞集団を容易に識別できました。比較として同一のサンプルに対し、CD56をPEで染色し、CD8をAPCで染色したうえで同一の測定を行ったところ、NK細胞およびNK T細胞の収率はほぼ同じでした。このことはAPCとAlexa Fluor 647を組合せも、実験結果に影響を与えないことを示しています。

例2：BFP、GFPとmCherry

Figure4:従来のスペクトラムビューアー由来のスペクトル

Figure5:4レーザーのAuroraシステムのスペクトラムプロットはBFP、GFPとmCherryのシグネチャが明確に異なることを示しています。

Figure6:AB2.2マウス胚性幹細胞は遺伝子改変により異なるfate markerの転写開始配列の制御下において安定的にBFP、GFPおよびmCherryを発現します。発現した安定した細胞株はその後分化条件下で培養され、回収し、蛍光タンパク質の発現を評価するために4レーザーAuroraシステムによって解析されました。自家蛍光の除去は解析結果の精度を高めるために使用されています。サンプルはEMBL、Neveu group、Cell Biology&BiophysicsのLuigi Russo、Hannah　L. Sladitschek、Pierre Neveuによりご提供いただきました。

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フルスペクトラムプロファイリング(FSP™)テクノロジーによる優れた光学パフォーマンス

高精度な多次元データを得るための能力がデータの次元性と二次元可視化アルゴリズムを効果的に利用するための鍵となります。Cytekの特許技術であるFSPテクノロジーは、Cytek AuroraシステムとCytek Aurora CSに使用されており、これらのシステムのユーザーは高精度なデータを作成することが可能です。OMIP-069(PMID: 32820910)におると、Cytek Auroraにて実現した40色免疫表現型パネルは、ソーティングが可能なCytek Aurora CSにおいても同等に使用可能であることが確認されました。

以下に説明します：

40色のヒトPBMCサンプルを調製しました。
Cytek AuroraシステムとCytek Aurora CSの両者においてリファレンスコントロールとサンプルを測定しました。
両システムから得られたデータについて、生細胞シングレットのCD45+リンパ球と単球の細胞集団をゲートし、UMAPを用いて2次元の可視化を行いました。
両システムから得られたデータのUMAPスキャタープロットは以下のように重なりを見せており、強い類似性を示しています。Auroraシステム(青)とCS(オレンジ)はそれぞれ同じパターンを示しており、ほとんど重なっていることが分かります。
両システムから得られたデータのUMAPデンシティプロットは並べて表示しています。

OMIP-069はもう読まれましたか？まだの場合はこちらからダウンロードして確認することができます。

SpectroFlo® CSソフトウェアによる解析ワークフロー

SpectroFlo CSソフトウェアはQCからデータ解析まで、いかなるアプリケーションも簡便に行うことのできるツールを搭載し、直感的な操作を提供します。

QC and Setup:
デイリーQCを実行し、装置のパフォーマンスを確認し、リファレンスコントロールの追加を行います。

Library:
実験のテンプレート、ワークシートテンプレート、蛍光色素の情報、QCビーズの情報などを作成、または削除できます。

Extra Tools:
異なる実験のコントロールデータを使用したデータのアンミキシング、またデータにバーチャルフィルターを適用することもできます。

Users:
管理者による各種設定が可能です。

Perferences:
ソフトウェアの表示設定をすることができます。デフォルトのプロットサイズ、テキストサイズ、フォント、ゲートカラー、プリントレイアウト、統計テーブルのオプションなどを設定できます。

実験のワークフロー

Acquisitionメニューから新しい実験を始め、以下の簡単な4つのステップに従ってデータを得ることができます。

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SpectroFlo® CSソフトウェアによるソートコントロール

SpectroFlo CSソフトウェアに搭載されているソーターコントロールウィンドウは様々な制御を通じて、下図の番号で示しているワークフローにより、良いソーティングの結果を得ることを手助けします。

流路内の未測定サンプルを回収できます。
ノズルサイズの選択、液滴のブレイクオフポイントの最適化、ストリームの設定、そして次回以降の測定のための設定を保存できます。
クロッグの検出を伴うソートモニタリングを可能にしたことによりソーティングを成功に導きます。
サンプルの撹拌と温度調整が可能です。
回収容器をチューブまたはプレートから選択できます。
回収側のチューブやプレートを回収するターゲットに合わせて調整します。この設定は次回以降のために保存できます。
ソーティング後に包括的なソートレポートを確認できます。ファイルとして書き出すことができます。

ライブビューカメラを使用することにより、それぞれのチューブの中央にストリームが一致するように設定でき、チューブ内の回収量も確認できます。
オートドロップディレイボタンをクリックすることで全自動のドロップディレイウィザードを開くことができます。
ソートストリームの調整またはドロップディレイの調整を手動で切り替えできます。
スライドバーを使用するかテキストボックスの値を変更するかによって、センターストリームを最適化できます。
Cytekが設定したソートモードを選択するかカスタムモードを作成することも可能です。
それぞれのプレートウェルかチューブに対して細胞集団およびソーティングの停止基準を定義できます。

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