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1. はじめに: Cytek フローサイトメーターで柔軟なアプリケーションを
2. 微小粒子の検出 (Aurora / Northern Lights共通)
3. 自家蛍光差分による解像度の向上 (Aurora / Northern Lights共通)
4. 近似波長蛍光色素、蛍光蛋白質の識別 (Aurora / Northern Lights共通)
5. UVレーザー搭載で更なる領域へ (Auroraのみ)
6. ブルーレーザー励起9色パネル (Northern Lightsのみ)
7. 3レーザーで24色パネル実験が可能 (Aurora / Northern Lights共通)
8. A New Reality: 3レーザー、24色による高解像度解析 (Aurora / Northern Lights共通)
9. プレートローダー (Aurora / Northern Lights共通)
10. ソフトウェア (Aurora / Northern Lights共通)

はじめに: Cytek フローサイトメーターで柔軟なアプリケーションを

Aurora

Auroraの革新的なテクノロジーは数多くのアプリケーションを実行可能にします。100mWの405nmレーザーと高感度バイオレットサイドスキャッター検出器によって、200nmに迫る粒子分解能をもたらします。Auroraを使用することで多彩な微小粒子解析アプリケーションが実行可能となります。

Northern Lights

Cytek社のフローサイトメーター、Northern Lightsは、革新的な技術により、通常ははるかに高額なシステムでのみ可能な機能が使用できます。100mWの405nmレーザー搭載システム（構成によっては非搭載）では、高感度のバイオレットサイドスキャッター検出器を搭載しており、100nmに近いサイズの粒子を分析することができます。Northern Lightsは、様々な微小粒子アプリケーションへの扉を開きます。
ソフトウェアの自家蛍光抽出ツールは、高い自家蛍光を持つサンプルを含む困難なアプリケーションに新たなレベルの分解能をもたらします。

微小粒子の検出 (Aurora / Northern Lights共通)

例1. ViroFlow

外被糖タンパク質にsuperfolder GFP (sfGFP)を発現するように遺伝子操作したマウス白血病ウイルス (MLV-124 nm ±14 nm) を測定した例です。

1. Bufferのみ
2. MLV with no sfGFP (MV-M-Zero)
3. MLV with sfGFP (MV-M-sfGFP)

すべてのサンプルは3レーザーAuroraで測定し、violet SSC でスレッシュホールドを掛けています。
ViroFlow Technologies (www.viroflowtechnologies.com)が供給するウイルスを使用しました。
データ解析にはDe Novo™ Software社製FCS Express 6を用いました。

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例2. ApogeeMix

1300nmから110nmのビーズ混合体であるApogeeMix(Apogee Flow Systems)をAuroraで測定した例です。最小サイズの粒子もバックグラウンドより高く容易に識別可能です。

データ解析にはDe Novo™ Software社製FCS Express 6を用いました。

自家蛍光差分による解像度の向上 (Aurora / Northern Lights共通)

ソフトウェアの自家蛍光抽出ツールは、高い自家蛍光を持つサンプルを含む困難なアプリケーションに新たなレベルの分解能をもたらします。

例1. PrimeFlow™ RNA Assay

ヒトU937細胞を用いたPrimeFlow™ RNAアッセイを実施しました。 Alexa Fluor® 488によりラベリングしたHMBS mRNAをNorthern Lightsで測定し、低発現（10コピー以下/細胞）の検出性をSpectroFlo®ソフトウェアによる自家蛍光差分無しと有りのデータ間で比較しました。

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例2: mCherry発現HeLa細胞

CRISPR-Cas9でmCherryレポーターを形質転換したHeLa細胞を測定しました。ノックインした内在性プロモーターにより、mCherryは発現します。蛍光タンパク質の導入細胞はCRISPR-Cas9処理32時間後に4レーザーのAuroraを用い測定しました。自家蛍光の差分機能を使用することで解像度が向上しています。
サンプル提供元 Malte Paulsen, Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, EMBL

近似波長蛍光色素、蛍光蛋白質の識別 (Aurora / Northern Lights共通)

いくつかの蛍光タンパク質や蛍光色素の組み合わせでは蛍光スペクトラムのオーバーラップが大きいため（Figure 1, 4, 7, 10）、従来のフローサイトメトリー技術では識別が困難です。Aurora/Northern Lightsは全レーザーの全蛍光波⻑スペクトラムシグネチャーを利用することでこの問題を解消し、共発現を含む集団が識別可能になります（Figure 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12）。

例1. GFP、YFP、CFPとDsRed

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例2. BFP、GFPとmCherry

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例3. APCとAlexa Fluor® 647

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例4. Qdot 705とBV711

UVレーザー搭載で更なる領域へ (Auroraのみ)

UVレーザーと64chの検出器を搭載した5レーザーAuroraは35色を超えるマルチプレックスアッセイを実現します。
UVレーザーを搭載することでAuroraの性能が次のレベルまで引き上げられます。

35-Color Panel

35色パネルの例
ヒト末梢血単核球を染色、洗浄したものを5レーザーAuroraで測定しました。

LIVE/DEAD™はThermo Fisher Scientificの商標です。
CF®はBiotiumの商標です。

t-SNE、FlowSOM解析

35色パネルをOMIQソフトウェア(www.omiq.ai)を用いt-SNE解析した結果。ダブレット除去、死細胞除去済のCD45陽性細胞を解析。t-SNE解析にあたり、スケーリングを最適化した全ドナーのデーターをGPU t-SNEアルゴリズムを用いて解析しました(上段)。矢印で示した細胞集団は、ドナー1でのみ見られました。クラスタリング解析はFlowSOMで行い、GPU t-SNEで図示しました。中段と下段はドナー1のCD3+/CD4+/CD57±/PD-1±/CD45RO+/CD95±/CD56±/CD45RA-/CCR7-/CD27-発現情報で着色したものです。

2D Dot Plots

ブルーレーザー励起 9色パネル (Northern Lightsのみ)

スペクトルサイトメーターによって、さまざま可能性の扉が開かれます。Northern Lightsを使用することで１もしくは２レーザーという少ないレーザー数のフローサイトメーターで複雑なマルチカラー実験が可能となります。 独自の光学システムにより、解像度を犠牲にすることなく、蛍光波長がオーバーラップした色素の併用が可能となり、色素選択の柔軟性が向上します。フィルターを組み替えることなく、すべてのアプリケーションに同一の構成が使用できるため実験セットアップの時間を節約し、実験エラーの可能性を最小限に抑えます。

末梢血単核細胞（PBMC）を解凍、染色、洗浄し、1レーザーNorthern Lightnsで測定しました。このブルーレーザー励起９色色素パネルでは、単球およびいくつかのCD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞サブセットが容易に同定できました。 このアッセイで測定したマーカーおよび蛍光色素を以下の表に例示します。

SPECIFICITY	FLUOROCHROME
CD45RA	Alexa Fluor® 488
CD3	Alexa Fluor® 532
CD25	PE
CCR7	PE/Dazzle™ 594
CD4	PE-Cy™5
CD45	PerCP-Cy™5.5
CD8	BD Horizon™ BB700
CD14	PerCP-eFluor® 710
CD127	PE-Cy™7

3レーザーで24色パネル実験が可能 (Aurora / Northern Lights共通)

Aurora/Northern Lightsの光学設計とSpectroFlo®ソフトウェアのUnmix機能を組み合わせることで、幅広い蛍光色素の選択、パネルの作成、フィルターの交換を必要としない簡単な機器セットアップが可能になります。3レーザー構成のNorthern Lightsは、幅広いアプリケーションに適したマルチパラメトリックデータを提供します。ヒト末梢血中の循環細胞サブセットを同定するために設計された24色パネル中のマーカーおよび蛍光色素を以下の表に例示します。

SPECIFICITY	FLUOROCHROME
CCR7	Brilliant Violet 421™
CD19	Super Bright 436
CD16	eFluor® 450
TCR γ/δ	BD Horizon™ BV480
CD14	Brilliant Violet 510™
CD8	Brilliant Violet 570™
CD1c	Brilliant Violet 605™
PD-1	Brilliant Violet 650™
CD56	Brilliant Violet 711™
CD4	Brilliant Violet 750™
CD28	Brilliant Violet 785™

SPECIFICITY	FLUOROCHROME
CD11c	BD Horizon™ BB515
CD45RA	Alexa Fluor® 488
CD3	Alexa Fluor® 532
CD25	PE
IgD	PE/Dazzle™ 594
CD95	PE-Cy™5
CD11b	PerCP-Cy™5.5
CD38	PerCP-eFluor® 710
CD57	PE-Cy™7

SPECIFICITY	FLUOROCHROME
CD27	APC
CD123	Alexa Fluor®647
CD127	BD Horizon™ APC R700
HLA DR	APC/Fire™ 750

‐ 24色パネルにはオーバーラップする蛍光色素が数多く含まれています

APC/Fire™ and PE/Dazzle™はBioLegend,Inc.所有の商標です。
Brilliant Violet™ はSirigen Group Ltd.の商標です。
BD Horizon™ とBrilliant Blue (BB) はBD Biosciencesの商標です。
Alexa Fluor®、 eFluor®、Super BrightはThermo Fisher Scientificの商標です。
Cy® and CyDye®はGE Healthcareの登録商標です。

Allophycocyanin (APC) conjugates: US Patent No. 5,714,386
PE-Cy7: US Patent Number 4,542,104.
APC-Cy7: US Patent Number 5,714,386.
商標および登録商標はそれぞれの所有者に帰属します。

A New Reality: 3レーザー、24色による高解像度解析 (Aurora / Northern Lights共通)

プレートローダー (Aurora / Northern Lights共通)

Automatic Micro-Sampling System(AMS)

実験目的に最適化したプリセット、あるいはカスタマイズした条件設定が可能です。AMSはAurora/Northern Lightsに組み込み、シームレスに実験ワークフローを実⾏できるようにデザインされており、使い易くかつ低キャリーオーバー、低デッドボリュームな実験環境を提供します。

ソフトウェア (Aurora / Northern Lights共通)

SpectroFlo®はQCから解析までを簡単に実⾏出来る直感的なワークフローツールを備えております。

Acquisition

実験ワークフロー

Acquisitionメニューから3ステップで新たな実験を開始可能です。