Curiosis社Celloger Mini Plus
ライブセルイメージングシステム
96および384ウェルプレートで作成した
スフェロイドの効果的なイメージング

ワケンビーテック株式会社

背 景・目 的

Curiosis社Celloger Mini Plusは、CO₂インキュベーター内に設置し、庫内環境を乱すことなく、培養細胞やスフェロイドなどをタイムラプス撮影できる小型のライブセルイメージングシステムです。Celloger Mini Plusは、培養容器(ステージ)ではなく、カメラ(レンズ)が設定した各ポジションに移動して撮影できるため、浮遊細胞、胚、スフェロイド、オルガノイドなど、振動で位置がずれてしまうようなサンプルの撮影にも適しています。更に、ディッシュやフラスコ以外に、96ウェルプレートや384ウェルプレートなどであっても、複数のポジションの画像を簡便な設定で撮影することができます。

本アプリケーションノートでは、96ウェルおよび384ウェルプレートの全ウェルで作成したスフェロイドについて、Celloger Mini Plusを使用し、効果的にイメージングを行うことができた事例をご紹介します。

Celloger Mini Plus

謝 辞

本アプリケーションノートの作成に当たり、東京女子医科大学医学部生化学講座 田中正太郎様に多大なるご協力およびデータ掲載のご承諾をいただきましたことをここに深く御礼申し上げます。

方 法

1.材料および使用機器

(1)スフェロイド作成に用いた細胞株および培地
　1）細胞株：HEK293T
　2）培　地：D-MEM(Low Glucose) with L-Glutamine and Phenol Red(富士フィルム和光純薬株式会社),10%FCS

(2)スフェロイド作成に用いた培養プレート
　1）PrimeSurface 96Uプレート(住友ベークライト株式会社 #631-21031)
　2）PrimeSurface 96Uプレート(住友ベークライト株式会社 #624-01441)
　※いずれも低吸着加工が施されており、浮遊させた細胞を添加するだけでスフェロイドが自然に形成される

(3)使用したCO₂インキュベーターおよびイメージング装置
　1）CO₂インキュベーター：Forma™ Direct Heat CO₂Incubator(Thermo Fisher Scientific社 #310)
　2）イメージング装置　  ：Celloger Mini Plus(Curiosis社 #CRCLG-MPBG10)

(使用したCelloger Mini Plusの主な仕様)
対物レンズ：10倍
視野　　　：0.57mm×0.43mm
カメラ　　：フル電動xyz移動、モノクロ5MP CMOS
撮影モード：明視野、蛍光(緑)
主な機能　：タイムラプス撮影、オートフォーカス、Zスタック、ステッチング(最大7×7視野)
その他　　：PCによるコントロール

2.スフェロイド作成プロトコルおよび撮影条件(96および384ウェルプレート共通)

　1）HEK293T細胞を9cmディッシュで培養する
　2）トリプトシンで剥離し、PBSに浮遊させる
　3）細胞数の計測
　4）200細胞/100µLとなるよう培地に浮遊させる

　5）マルチウェルプレートに各ウェル100µLずつ分注する

　6）37℃インキュベーターで1日培養

　7）(必要に応じて)薬剤を添加、さらに1日培養

　8）Celloger Mini Plus(対物10倍)で観測・撮影(撮影ポジション設定方法)
　　 A1ウェルでxyz座標を調節(z座標はスフェロイドの輪郭が最も明瞭になる高さとした)
　　 全てのウェルにコピー&ペースト(全ウェルで「ウェル内のxyz座標」が同一になるよう設定)
　　「明視野のみ」、「オートフォーカスOFF」の設定で撮影

結 果

96および384ウェルプレートの全ウェルにおいて、効果的なスフェロイドを撮影することができた。
1回の撮影は、96ウェルプレートでは11分、384ウェルでは40分で終了した。
スフェロイドが視野外にずれていくときは、ズレを加味したxyzを再登録し、新たに撮影した。複数の撮影結果のうち適正に撮影できたものを採用した。
各ウェルで撮影された画像、および自動生成されたプレート全体のタイリング画像により、各ウェルのスフェロイドについて、条件による状態の違いなどを観察することができた。

1.PrimeSurface 96Uプレートの撮影データ例

(1)プレート全体のタイリング画像

(1)A1ウェルの撮影画像

2.PrimeSurface 384Uプレートの撮影データ例

(1)プレート全体のタイリング画像

(1)A1ウェルの撮影画像

【お客様のコメント(Celloger Mini Plusについて)】

• ユーザーフレンドリーな操作性と機能で、やりたいと思うことが簡単に実行できてストレスレスだった
  特に座標のコピー&ペースト機能、センタリング機能、オートフォーカス機能、撮影方向の設定(行か列か、一方向か往復か)、
  ホルダーの簡単着脱とぐらつきのないところ、など
• 5MPの鮮明な画像に満足した。
• 撮影後、写真をマルチウェルの配置にまとめて1枚の画像を用意してくれる機能がとても役に立った
• インキュベーターを開けずに撮影できたことが、スフェロイドにとってもユーザーにとっても低負荷だった
  CO₂の消費も少なかった
• 稼働時の振動を感じなかった。音が静かであり、スフェロイドも全く動かなかった
• 撮影時間が短く、取り直しがしたいときにすぐに撮影できて助かった