pHプロファイルを利用したH.polymorphaの蛋白質発現の最適化

- メタノール資化酵母
- 組み換え蛋白質生産のホストとして広く利用されています
- 利点
- 蛋白質の糖付加経路
⇒過剰な糖付加はされない
- 強力で限定できる発現制御
⇒メタノール誘導プロモーター
- 発現量
⇒g/Lという強力な発現を有する
- 小スケール培養時には、最大収率のための最適pH範囲の評価が難しい
ボトルネック:pH関連が謎に包まれている
マイクロスケールの低pHオンラインセンサーがお役に立ちます
BioLector® II/Proの低pH(4-6)光学センサーがpH測定の幅を広げます

図1: H. polymorpha RB11 FMD-GFP のマイクロ流路バッチ培養。GFPとpHをオンライン測定
3 M NaOHとHCl でのマイクロ流路2方向pHコントロール
- 低pH光学センサーは、pH4-6の範囲で再現性の高いpH測定が可能
- 専用プレート
MTP-MF32-BOH3
フラワープレート32 濁度・蛍光・DO・pH測定用
(Type3 マイクロ流路付)
- pH制御は、NaOHとHClをマイクロ流路で送液
- 蛋白質発現量は、蛍光(GFP)を測定することで検出可能
- 強力なメタノール誘導プロモーターの利用
ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD:Formate dehydrogenase)
メタノールオキシダーゼ(MOX:methanol oxidase)
グルコース枯渇時の抑制解除により、GFP発現が開始されます。
結果:Space-time yield (STY)

図2 : 違うpH条件でのH. polymorpha FMD-GFP 培養のGFP 単位時間当たり収率
pH値をマイクロ流路でコントロールできるよう、BioLector® Pro で培養(FlowerPlate®使用)
- より低いpHで、単位時間当たりの収率(STY)が明確に増加
- マイクロスケールでのpH値を初期段階からオンラインスクリーニング
- 関連するプロセス条件での種のスクリーニングが可能
- 生理学範囲外のpHプロファイルが可能(蛍光によって)
GFP遺伝子配列は他の目的の遺伝子配列に変更することが可能です。
種のスクリーニング結果とプロセスパラメータの最適化は、その後に続く製造段階のpHに適合する条件として利用できます。
本資料はm2p社から提供されました。
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